تکامل عطر میوه: محدودیت های فیلوژنتیکی و رشدی

خلاصه

زمینه

رایحه میوه به طور فزاینده ای به عنوان یک سیگنال تکامل یافته شناخته می شود که عملکرد آن جذب پراکنده کننده دانه های حیوانی و تسهیل تولید مثل گیاه است. با این حال، مانند همه صفات، بوی میوه احتمالاً در پاسخ به فشارهای انتخابی متناقض و محدودیت های مختلف تکامل می یابد. دو محدودیت عمده عبارتند از: (۱) محدودیت های فیلوژنتیک، که در آن صفات به جای انطباق با شرایط فعلی از اجداد به ارث برده می شوند و (۲) محدودیت های رشد، اگر فنوتیپ ها با بیان سایر صفات در درون فرد محدود شوند. ما با محاسبه سیگنال فیلوژنتیکی در میوه‌های رسیده ۹۸ گونه از سه سایت مورد مطالعه، آزمایش کردیم که آیا محدودیت‌های فیلوژنتیکی در تکامل بوی میوه نقش دارند یا خیر. سپس با بررسی اینکه آیا میوه‌های رسیده تمایل به انتشار ترکیباتی دارند که از نظر شیمیایی مشابه و مسیرهای بیوسنتزی مشترک با ترکیبات ساطع شده از میوه‌های نارس هم‌نوعی که از آن‌ها رشد می‌کنند، اهمیت محدودیت‌های رشدی را برآورد کردیم.

نتایج

ما نشان می‌دهیم که گونه‌های نزدیک به هم شباهت بیشتری به یکدیگر ندارند تا گونه‌های بسیار متمایز، بنابراین نشان می‌دهد که عطر میوه سیگنال فیلوژنتیک کمی را نشان می‌دهد. در عین حال، اگرچه میوه های رسیده و نارس از یک گونه تمایل به انتشار مواد شیمیایی متفاوتی دارند، اما تمایل به استفاده از مواد شیمیایی ناشی از مسیرهای بیوسنتزی مشابه دارند، بنابراین نشان می دهد که برخی از محدودیت های رشدی عطر میوه رسیده را تعیین می کند.

نتیجه گیری

نتایج ما چشم انداز پیچیده ای را که در آن عطر میوه تکامل یافته است، برجسته می کند. از یک طرف، تکامل عطر میوه به اجداد مشترک محدود نمی شود. از سوی دیگر، طیف مواد شیمیایی که می‌توان در میوه‌های رسیده به کار برد، احتمالاً به دلیل نیازهای میوه‌های نارس محدود شده است.

زمینه

میوه‌های رسیده مجموعه وسیعی از متابولیت‌های ثانویه را سنتز می‌کنند که عملکردهای مختلفی را انجام می‌دهند [ ۱ ] یا به طور بالقوه هیچ عملکردی ندارند [ ۲ ]. بیشتر کارها بر روی عملکردهای تطبیقی ​​این متابولیت ها بر روی ترکیبات نسبتاً بزرگ و غیر فرار با عملکردهای مشخص مانند دفاع در برابر آنتاگونیست های میکروبی و بی مهرگان متمرکز شده است [ ۳ ، ۴ ، ۵ ]. در مقابل، مطالعه ترکیبات آلی فرار میوه (VOCs) – متابولیت‌های ثانویه سبک وزن که میوه‌ها منتشر می‌کنند و مسئول تنوع فوق‌العاده رایحه‌های میوه هستند – اندک است. در سال های اخیر علاقه فزاینده ای به اکولوژی و تکامل عطر میوه وجود داشته است [ ۶ ]. در حالی که فرض بر این است که حداقل برخی از VOCهای میوه نیز در دفاع از میوه نقش دارند [ ۷ ، ۸ ]، بیشتر این مطالعات بر نقش رایحه میوه به عنوان یک جاذب برای مهره داران پراکنده بذر تمرکز کرده اند [ ۶ ، ۹ ، ۱۰ ، ۱۱]. , ۱۲ , ۱۳ , ۱۴ , ۱۵ , ۱۶ , ۱۷ , ۱۸ , ۱۹ , ۲۰ ].

بیشتر کارها بر روی عملکرد اکولوژیکی عطر میوه بر روی تعامل بین خفاش ها و انجیر متمرکز شده است ( Ficus spp.). مشخص شده است که رایحه انجیر به عنوان یک جذب کننده برای خفاش های پراکنده بذر در گونه های مختلف هم در پالئوتروپیک و هم در نئوتروپیک عمل می کند، و گونه های پراکنده خفاش تمایل به انتشار کیفی متفاوت [ ۹ ، ۱۰ ] و بوی بیشتری نسبت به گونه های پراکنده در پرندگان دارند [ ۲۱] ]. علاوه بر این، مقایسه گونه‌های مختلف انجیر نشان داد که بوی سیکونیا در مرحله پراکندگی تنها در گونه‌های پراکنده خفاش تغییر می‌کند [ ۱۱ ]، که نشان می‌دهد تولید عطر احتمالاً یک سیگنال تکامل یافته است. شواهدی که فراتر از خفاش ها و انجیر است و نشان می دهد که رایحه میوه در فعل و انفعالات پریمات و گیاه نقش دارد، در سال های گذشته جمع شده است [ ۱۲ ، ۱۶ ، ۱۷ ]. اخیراً نشان داده شده است که میوه‌های گونه‌هایی که در پراکندگی بذر توسط لمورها تخصص دارند از طریق رایحه به رسیدن سیگنال [ ۱۸ ] و حتی محتوای مواد مغذی [ ۲۲ ، ۲۳ ] تکامل یافته‌اند، و رایحه میوه نقش عمده‌ای در استراتژی‌های کسب غذا دارد. از میمون های کاپوچین [ ۲۰ ]. به این ترتیب، اذعان فزاینده ای وجود دارد که عطر میوه به عنوان یک سیستم ارتباطی بین گیاهان و پخش کننده دانه عمل می کند.

با این حال ممکن است که سنتز و انتشار VOC میوه رسیده عمدتاً نتیجه عوامل غیرمرتبط با برهمکنش با پخش کننده های بذر باشد [ ۲۴ ]. اینها ممکن است شامل پاسخ های تطبیقی ​​به عوامل دیگر مانند عوامل ادافیک یا آنتاگونیست های حیوانی باشد. در مواردی که بیان فنوتیپ حداقل تا حدی با بیان فنوتیپ‌های دیگر تعیین می‌شود، ممکن است شامل محدودیت‌های غیرسازگار مانند نسب باشد، اگر یک صفت به جای انطباق با الزامات خاص گونه، به ارث برده شود، یا محدودیت‌های رشدی. ۲۵ ، ۲۶ ]. سایر صفات میوه، مانند اندازه، جرم و محتوای مواد مغذی، به جای انتخاب توسط حیوانات به اصل و نسب مشترک نسبت داده شده است [ ۲۷ ، ۲۸ ]. مطالعه دیگری میزان یکپارچگی فنوتیپی (اندازه گیری همبستگی صفت که ممکن است نشان دهنده محدودیت در تکامل صفت باشد) را کمی سازی کرد و دریافت که رنگ میوه نسبت به اندازه میوه ادغام فنوتیپی کمتری را نشان می دهد [ ۲۹ ]. مشخص شده است که رنگ میوه سیگنال فیلوژنتیک قوی را نشان نمی دهد [ ۳۰ ، ۳۱ ]، و نسبت به گل ها محدود است، که احتمالاً نتیجه محدودیت های شیمیایی است [ ۳۱ ]. روی هم رفته، این مطالعات نشان می دهد که در مقایسه با صفات مورفولوژیکی، رنگ میوه ممکن است در پاسخ به رفتار میوه خوار تغییر شکل پذیرتر باشد، اما تکامل آن کاملاً بدون محدودیت نیست.

محدودیت‌های مربوط به تکامل VOC گیاه کمتر مورد توجه قرار گرفته است، اما یک مطالعه نشان داد که انتشار VOC گیاهان یکپارچگی فنوتیپی کمتری نسبت به پروفایل‌های VOC حشرات نشان می‌دهد، و گل‌ها در گیاهان درجه پایین‌تری از یکپارچگی فنوتیپی را نسبت به برگ نشان می‌دهند [ ۳۲ ]. دفاع شیمیایی غیرفرار در برگها سیگنال فیلوژنتیکی کمی نشان می دهد یا هیچ سیگنال فیلوژنتیکی را نشان نمی دهد که حاکی از محدودیت های فیلوژنتیکی ضعیف است [ ۳۳ ، ۳۴ ].

تا کنون، طبق اطلاعات ما، تنها دو مطالعه به این موضوع پرداخته اند که آیا واریانس بین گونه ای در رایحه میوه ممکن است عمدتاً ناشی از اجداد مشترک باشد. هاجکیسون و همکاران [ ۱۰ ] میزان سیگنال فیلوژنتیک را در ۹ گونه فیکوس اندازه‌گیری کرد و نتایج متفاوتی را گزارش کرد: نمایه‌های رایحه انجیرهای پراکنده در خفاش‌ها بیشتر از انجیرهای پراکنده در پرندگان مشابه یکدیگر هستند، اما در گونه‌های پراکنده خفاش. گونه های نزدیک مرتبط تمایل به خوشه بندی دارند. این نشان می‌دهد که محافظه‌کاری فیلوژنتیکی می‌تواند در مقیاس‌های مختلف متفاوت ظاهر شود، و همچنین در جایی که فشارهای انتخابی ضعیف‌تر هستند، آشکارتر است. اخیراً، Nevo و همکاران. [ ۱۸ ] نشان داد که در سیستمی در ماداگاسکار، میوه‌های رسیده گونه‌های نزدیک به هم دسته‌های رایحه شیمیایی مشابهی ندارند. با این حال، این مطالعات یا محدود به یک جنس یا یک سیستم واحد بود. علاوه بر این، یک محدودیت عمده این بود که هر دو شباهت را در سطح ترکیب بررسی کردند. بسیاری از VOCهای میوه از مسیرهای بیوسنتزی رایج [ ۳۵ ، ۳۶ ] مشتق می شوند و فقط در مراحل بعدی، اغلب در مسیرهای بسیار غیر اختصاصی، اصلاح می شوند [ ۳۷ ]. بنابراین، رویکرد برخورد با VOCهایی که گیاهان منتشر می‌کنند به‌عنوان مستقل، و به همان اندازه احتمال دارد که در زمینه انتخاب تکامل پیدا کنند، ممکن است تفاوت بین گونه‌هایی را که نمایه‌های بوی آن‌ها تحت سلطه VOC‌های مختلفی است که مسیر بیوسنتزی مشترکی دارند، بیش از حد برآورد کند. در نتیجه، محدودیت‌های فیلوژنتیکی ممکن است در تکامل صفات میوه نقش داشته باشد، اما مشخص نیست که تا چه حد ممکن است بر بوی میوه تأثیر بگذارد.

علاوه بر این، بوی میوه ممکن است به دلیل محدودیت های رشدی محدود شود. VOC های مختلف در هر دو بافت رویشی و زایشی (گل و میوه) گیاه سنتز می شوند [ ۱۹ ، ۳۸ ، ۳۹ ، ۴۰ ]. سنتز و انتشار VOC در میوه‌های رسیده ممکن است با در دسترس بودن ژن‌های کدکننده آنزیم که عمدتاً برای عملکردهای دیگر انتخاب شده‌اند، محدود شود. علاوه بر این، الگوهای بیان در میوه ها ممکن است با تنظیم مثبت ژن ها در سایر بافت های گیاهی هدایت شوند [ ۲ ، ۴۱ ]. بنابراین، ممکن است رایحه میوه رسیده فقط به VOCهایی که برای انتشار در این مرحله انتخاب شده اند محدود نباشد، بلکه بیشتر نتیجه سنتز VOC در سایر قسمت های گیاه باشد.

در اینجا، بررسی می کنیم که آیا تکامل عطر میوه در معرض محدودیت های فیلوژنتیکی و رشدی است یا خیر. ما ابتدا سیگنال فیلوژنتیک را در سه مجموعه داده مستقل از ماداگاسکار (پارک ملی Ranomafana-RNP؛ ۳۰ گونه)، اوگاندا (پارک ملی Kibale-KNP؛ ۴۹ گونه)، و آلمان (Ulm؛ ۱۹ گونه) اندازه‌گیری می‌کنیم. از آنجایی که بسیاری از VOC ها از مسیرهای بیوسنتزی رایج مشتق می شوند، محافظه کاری فیلوژنتیکی می تواند نه تنها در انتشار VOC های مشابه در گونه های مرتبط نزدیک، بلکه در انتشار VOC های مرتبط با بیوشیمیایی، به عنوان مثال، VOC هایی که مسیرهای بیوشیمیایی مشترک دارند نیز آشکار شود. بنابراین ما سیگنال فیلوژنتیک را در عطر میوه در دو سطح محاسبه می‌کنیم: سطح ترکیبی و کلاس شیمیایی، بر اساس مسیرهای اصلی بیوشیمیایی شناخته شده که منجر به اکثر VOCهای گیاهی می‌شوند. برای ارزیابی اینکه آیا بوی میوه توسط محدودیت‌های رشدی محدود می‌شود، بررسی می‌کنیم که آیا نمایه VOC میوه رسیده شبیه میوه‌های نارس هم‌نوعی در زیرمجموعه‌ای از ۳۰ گونه از یک سایت مطالعه است، که از آن اطلاعاتی برای میوه‌های نارس نیز داشتیم. پیش‌بینی ما این است که از آنجایی که میوه‌های رسیده مستقیماً از میوه‌های نارس ایجاد می‌شوند، اگر محدودیت‌های رشدی بر بوی میوه رسیده غالب باشد، باید شباهت زیادی بین میوه‌های رسیده و نارس ایجاد کند. از آنجا که نشان داده شده است که فشارهای انتخابی برای سیگنال رسیدن به حیوانات می تواند رایحه میوه های رسیده و نارس را در سطح ترکیبی در این سیستم متفاوت کند [ ۱۸ ]، ما بر شباهت در سطح کلاس شیمیایی تمرکز می کنیم.

نتایج

محدودیت های فیلوژنتیکی

در هر سه سیستم، هیچ سیگنال فیلوژنتیکی در سطح ترکیب یا کلاس پیدا نکردیم، بنابراین نشان می‌دهد که رایحه میوه رسیده با اصل و نسب مشترک توضیح داده نمی‌شود (جدول ۱ ؛ فایل اضافی ۱ : شکل S1، فایل اضافی ۲ : شکل S2، فایل اضافی ۳ : شکل S3).

بحث

نتایج ما نشان می‌دهد که در سه مکان مورد مطالعه در مناطق گرمسیری و معتدل، عطر میوه رسیده هیچ اثر قابل‌توجهی از سیگنال فیلوژنتیک را نشان نمی‌دهد، یعنی تمایل گونه‌های مرتبط نزدیک به شباهت به یکدیگر. این در هر دو سطح ترکیبی و کلاس شیمیایی سازگار است. این نشان می دهد که بوی میوه رسیده به شدت توسط اجداد مشترک محدود نمی شود و احتمالاً در برابر فشارهای انتخابی توسط گروه های پراکنده محلی، پاتوژن ها یا شکارچیان یا تغییر در نتیجه رانش غیر انطباقی انعطاف پذیرتر است. قابل توجه است که سیگنال فیلوژنتیک در سطح کلاس شیمیایی قوی تر نیست. ویژگی پایین آنزیم‌های اصلاح‌کننده مرحله آخر نشان می‌دهد که تغییرات در طبقات شیمیایی، یعنی در سطح ترکیب، باید نسبتاً آسان به دست آید. تغییر در کلاس ترکیب به ماشین آلات بیوسنتزی متفاوتی نیاز دارد که پیش سازهای مختلف را پردازش می کند و بنابراین پیش بینی می شود که محافظه کارانه تر باشد.

یک توضیح احتمالی این است که تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک ما از گروه وسیعی از گونه‌ها از چندین خانواده گیاهی و در واقع منشأهای متعدد میوه‌های گوشتی استفاده کرد. این امکان وجود دارد که زمان پس از واگرایی بسیاری از کلادها برای تغییرات عمده در تولید عطر کافی باشد. ۹۸ گونه پوشش داده شده در اینجا تنها تعداد کمی از گیاهان تولید کننده میوه های گوشتی هستند. در حالی که تجزیه و تحلیل مشابه در مقیاس وسیع تر ممکن است ساختار فیلوژنتیک قوی تری را نشان دهد، با توجه به مشکلات فنی انجام تجزیه و تحلیل شیمیایی در چنین مقیاسی، بعید است که داده های مورد نیاز به زودی در دسترس قرار گیرند. در واقع، مطالعه فعلی احتمالاً بزرگترین مجموعه داده منتشر شده از شیمی عطر میوه را نشان می دهد. یک جایگزین مولدتر تمرکز بر نمونه برداری گسترده تر در یک کلاد فیلوژنتیکی باریک تر است، که در آن اثرات فیلوژنی به احتمال زیاد آشکار می شود.

در همان زمان، در حالی که تعداد گونه‌های موجود برای تجزیه و تحلیل درون جنس در نمونه‌های ما بسیار کم است، از نظر کیفی به نظر می‌رسد که حتی در واگرایی‌های اخیر، پروفایل‌های شیمیایی میوه رسیده، فیلوژنی را منعکس نمی‌کنند. به عنوان مثال، پنج عضو از خانواده Rutaceae، شش عضو از Rubiaceae، و همزادانی مانند Cordia و Solanum به گونه های بسیار دور بیشتر شبیه هستند تا به یکدیگر (پرونده اضافی ۱ : شکل S1، فایل اضافی ۲ : شکل S2). در مقابل، نه گونه فیکوس از KNP محافظه کاری قوی تری را در سطح طبقه نشان می دهند (پرونده اضافی ۲ : شکل S2)، اما در همان زمان پنج گونه فیکوس از ماداگاسکار این گونه نیست (پرونده اضافی ۱ : شکل S1). بنابراین، حتی اگر تجزیه و تحلیل کمی فیلوژنتیک ممکن است تحت تأثیر فیلوژنی عمیق سیستم‌های مدل قرار گیرد، الگوی کلی این است که حتی در کلاس‌های فیلوژنی نیز نمی‌تواند تنوع رایحه میوه را توضیح دهد، و گونه‌ها اغلب شبیه‌تر به گونه‌های مرتبط هستند که در آن‌ها. میوه های گوشتی در برخی موارد به طور مستقل تکامل یافته اند.

در مقابل، ما شواهدی برای محدودیت‌های رشدی در عطر میوه‌های رسیده پیدا کردیم، زیرا مقادیر نسبی کلاس‌های VOC در میوه‌های رسیده و نارس همبستگی مثبت بالایی را نشان داد. بسیاری از گونه‌های میوه‌ای که در اینجا مورد تجزیه و تحلیل قرار می‌گیرند، در مورد پراکندگی بذر توسط لمورها تخصص دارند و برای نشان دادن رسیدن به بوته‌ای انتخاب شده‌اند که به طور قابل‌توجهی با بوی میوه‌های نارس متفاوت است [ ۱۸ ]. نتایج ما حاکی از آن است که در حالی که تغییر در مشخصات بوی یک میوه پس از رسیدن می تواند با تغییر VOC های منفرد منتشر شده به دست آید، این ترکیبات تمایل دارند به همان کلاس های شیمیایی تعلق داشته باشند. بنابراین، به نظر می‌رسد که تغییر ساده‌تر بیوشیمیایی در مشخصات رایحه در کلاس شیمیایی برای رسیدن به هدف سیگنال‌دهی به پراکنده‌کنندگان دانه مهره‌داران کافی است. تنها استثنا برای این قاعده استرهای آلیفاتیک است که در میوه‌های رسیده حتی زمانی که در میوه‌های نارس وجود ندارند، بیشتر رایج هستند [ ۱۸ ]. استرها محصول فرآیند پایین دستی هستند که در آن محصولات بسیاری از مسیرهای اساسی‌تر مورد بحث در اینجا به عنوان زیرلایه استفاده می‌شوند. به این ترتیب، آنها احتمالاً بهترین مثال برای VOCهای میوه رسیده هستند که توسط شیمی میوه نارس محدود نمی شوند.

از طرف دیگر، ممکن است همبستگی زیاد بین میوه های رسیده و نارس در سطح کلاس نشان دهنده سازگاری باشد و نه محدودیت. عملکرد اکولوژیکی بسیاری از VOC ها ناشناخته است، اما انتظار می رود که حداقل برخی از آنها در دفاع از میوه ها در برابر شکارچیان و عوامل بیماری زا نقش داشته باشند [ ۸ ]، و در مواردی که عملکرد یکسانی در میوه های رسیده و نارس لازم است، یک شباهت وجود داشته باشد. انتظار می رود بین آنها در دست انتخاب باشد. در عین حال، در این مورد ما انتظار تشابه بالاتری را در سطح ترکیب خواهیم داشت زیرا برای گیاه ارزان‌تر است که به سادگی به سنتز ترکیبات مشابه ادامه دهد تا اینکه به سایر ترکیبات مرتبط با مواد شیمیایی روی آورد، که اینطور نیست [۱۸ ] . . بنابراین، ترکیبی از تنوع بالا در سطح ترکیب و شباهت در سطح کلاس مطابق با مدلی است که در آن میوه‌ها برای تغییر عطر خود در هنگام رسیدن به میوه‌خواران انتخاب می‌شوند [ ۱۷ ، ۱۸ ]، اما محدود به به مواد شیمیایی از همان مسیر بیوسنتزی تکیه کنید.

نتیجه گیری

نتایج ما نشان می‌دهد که رایحه‌های میوه‌ای گونه‌های نزدیک به هم تمایلی به مشابه ندارند و اغلب شبیه گونه‌های بسیار مرتبط هستند، بنابراین نشان می‌دهد که محافظه‌کاری فیلوژنتیکی در عطر میوه رسیده وجود ندارد یا کمی وجود دارد. در عین حال، در درون گونه‌ها، مشخصات بیوشیمیایی میوه‌های نارس به عنوان طرحی عمل می‌کند که عطر میوه رسیده می‌تواند از آن جدا شود، اما در درجه اول در سطح ترکیبی ظریف‌تر. تأثیر متقابل بین محدودیت‌های فیلوژنتیک ضعیف و رشد قابل توجه، یک چشم‌انداز تطبیقی ​​پیچیده را نشان می‌دهد که ممکن است عطر میوه در آن ایجاد شود: گیاهان می‌توانند بوی خود را نسبتاً آسان تغییر دهند، اما نمی‌توانند این کار را بدون تغییر عطر میوه نارس نیز انجام دهند، که ممکن است هزینه‌های دیگری را به همراه داشته باشد. این نتایج تا حدی موازی با الگوهای مشاهده شده برای رنگ میوه است، که نسبتاً عاری از فیلوژنی است [ ۳۰ ، ۳۱ ]، اما ممکن است توسط شیمی گل ها، که از آن رشد می کنند، محدود شود [ ۳۱ ]. استفاده از رویکردهایی که ما در اینجا در نمونه بزرگی از گونه‌های نزدیک به هم، ترجیحاً از زیستگاه‌های متنوع اتخاذ کردیم، ممکن است نتیجه‌گیری‌هایی را که در اینجا به دست می‌آید تنظیم کند و نور بیشتری را در مورد تکامل عطر میوه‌ها روشن کند.

مواد و روش ها

نمونه‌هایی از سه محل مطالعه جمع‌آوری، نمونه‌برداری و با استفاده از پروتکل‌های مختلف مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و بنابراین به طور جداگانه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند (فایل اضافی ۴ : جداول S2-8). همه داده‌های خام، از جمله گونه‌ها، تعداد نمونه‌ها در هر فرد و گونه، و داده‌های رایحه در فایل اضافی ۴ موجود است : جداول S1-8.

پارک ملی Ranomafana، ماداگاسکار (RNP) ۴۳۴ میوه رسیده و ۴۲۸ میوه نارس از ۹۰ فرد از ۳۰ گونه (پرونده اضافی ۴ : جداول S2-3، S6-7) استفاده شد. داده ها از Nevo و همکاران گرفته شده است. [ ۱۸ ]. روش های نمونه گیری و تجزیه و تحلیل را در آنجا ببینید. نمونه ها مشابه نمونه های اولم پردازش و تجزیه و تحلیل شدند (به زیر مراجعه کنید).

پارک ملی کیبال، اوگاندا (KNP) ما از داده‌های منتشر شده در Nevo و همکاران استفاده کردیم. ۲۰۱۷ [ ۸ ]. همه نمونه‌ها در ژانویه تا ژوئن ۲۰۱۶ جمع‌آوری شدند. VOCهای بین ۲ تا ۱۰ میوه از هر گونه تا ۴ ساعت پس از جمع‌آوری نمونه‌برداری شدند. ۲۸۵ میوه رسیده از ۴۹ فرد از ۴۹ گونه استفاده شد (فایل اضافی ۴ : جدول S4). VOCهای میوه با استفاده از روش فضایی پویا جمع آوری شدند. ما میوه ها را در کیسه های فر قرار دادیم (کیسه های فر بزرگ، Reynold’s™). ما از پمپ‌های (Gilian 5000، Sensidyne™) برای کشیدن هوا از طریق کیسه با سرعت ۱ لیتر در دقیقه به مدت ۴ ساعت استفاده کردیم. هوای ورودی با استفاده از کربن فعال (سیگما آلدریچ) فیلتر شد. هوای خروجی حاوی VOC توسط یک لوله جاذب حاوی دو تله VOC (Amberlite XAD-2™، ۴۰۰-۲۰۰ میلی گرم، Sigma-Aldrich) نمونه برداری شد. VOCs با استفاده از ۳ میلی لیتر n-هگزان (Sigma Aldrich) از تله استخراج شد که به مدت ۵ دقیقه به صورت دستی تکان داده شد.

پس از استخراج، به هر ۱۹۰ میکرولیتر از هر نمونه، محلول ۱۰ میکرولیتری از یک استاندارد داخلی (هپتادکان، ۲۰۰ نانوگرم در میلی لیتر، محلول در هگزان) اضافه کردیم. سپس این محلول ها با استفاده از جریان ملایم نیتروژن تا ۲۰ میکرولیتر تغلیظ شدند. ما نمونه‌ها را با تزریق ۲ میکرولیتر به کروماتوگرافی گازی Agilent 7890B با ستون DB-5 (Agilent؛ ۳۰ m × ۰.۲۵ mm × ۰.۲۵ میکرومتر)، همراه با یک طیف‌سنج جرمی بی‌اثر Agilent 5977A که در حالت یونیزاسیون الکترون (EI) کار می‌کند، تجزیه و تحلیل کردیم. ما از یک خودکار برای تزریق نمونه‌ها بدون تقسیم بر روی یک سیستم تزریق سرد (Gerstel) استفاده کردیم، که آستر را در دمای ۱۰ درجه سانتی‌گراد نگه داشت. سپس لاینر در دمای ۱۲ درجه سانتیگراد در دقیقه تا ۳۰۰ درجه سانتیگراد گرم شد، دمایی که به مدت ۴ دقیقه در آن نگه داشته شد. سپس VOCهای تبخیر شده به ستون منتقل شدند. دمای فر روی ۴۵ درجه سانتیگراد تنظیم شد و از هلیوم به عنوان گاز حامل (۱ میلی لیتر در دقیقه) استفاده شد. برنامه فر ابتدا در دمای ۴۵ درجه سانتیگراد به مدت ۱ دقیقه نگه داشته شد. سپس در دمای ۷ درجه سانتیگراد در دقیقه تا ۳۱۰ درجه سانتیگراد گرم شد. سپس به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۳۱۰ درجه سانتیگراد نگهداری شد. دمای خط انتقال روی ۲۵۰ درجه سانتی گراد تنظیم شد. آنالیت ها در محدوده m/z 40-300 Da ثبت شدند.

آلاینده ها بر اساس حضور آنها در نمونه های شاهد (کیسه های خالی) نمونه برداری شده در شرایط مشابه با نمونه های میوه شناسایی شدند. ما همچنین آلاینده های شناخته شده (فتالات ها، سیلوکسان ها) را حذف کردیم. مقدار ترکیبات با استفاده از Amdis 2.71 اندازه گیری شد و هویت آنها بر اساس شاخص های نگهداری منتشر شده و طیف جرمی (کتابخانه NIST 11) تعیین شد.

اولم، آلمان نمونه‌های میوه در اولم در اکتبر تا نوامبر ۲۰۱۷ در جنگل‌های اطراف دانشگاه اولم، اولم، آلمان جمع‌آوری شد. ما گونه‌ها را به‌طور فرصت‌طلبانه انتخاب کردیم و همه گونه‌های میوه‌های گوشتی را که می‌توانستیم حداقل سه نفر از آنها به دست آوریم، وارد کردیم. ما ۵۹۲ میوه از ۸۸ فرد از ۱۹ گونه به دست آوردیم (فایل اضافی ۴ : جدول S5). نمونه‌های میوه به آزمایشگاه آورده شدند و مشابه نمونه‌های RNP پردازش شدند، همانطور که در Nevo و همکارانش توضیح داده شد. ۲۰۱۸ [ ۱۸ ]. به طور خلاصه، ما میوه‌ها را در محفظه‌های نمونه‌گیری ساخته شده از کیسه‌های فر ۴۰ سانتی‌متری (Toppits) قرار دادیم و از VOC میوه‌ها با استفاده از نمونه‌گیری نیمه دینامیک روی تله‌های VOC خودساخته حاوی مخلوطی از Carbotrap، Tenax و Carbosieve S-III (همه Sigma-) نمونه‌برداری کردیم. آلدریچ) به نسبت مساوی. ما مواد شیمیایی به دام افتاده را با استفاده از کروماتوگرافی گازی Agilent 7890B با ستون Agilent DB-5 (30 متر × ۰.۲۵ میلی متر × ۰.۲۵ میکرومتر)، و یک سیستم تزریق سرد (CIS 4C، Gerstel)، همراه با طیف‌سنج جرمی Agilent 5977A تجزیه و تحلیل کردیم. دمای TDU ابتدا روی ۱۰ درجه سانتیگراد تنظیم شد و پس از ۱ دقیقه در دمای ۱۰ درجه سانتیگراد ۱۵ درجه سانتیگراد در دقیقه به ۳۰۰ درجه سانتیگراد رسید. سپس ۱۵ دقیقه دیگر روی این دما قرار گرفت. سپس VOCهای جذب شده به لاینر منتقل شدند که تا ۱۰۰- درجه سانتیگراد خنک شد. سپس لاینر با سرعت ۱۲ درجه سانتیگراد در دقیقه تا ۲۹۰ درجه سانتیگراد شروع به گرم شدن کرد و به مدت ۶ دقیقه در این سطح نگه داشت. نمونه سپس به ستون فرستاده شد که روی ۵۰ درجه سانتیگراد تنظیم شد. پس از یک دقیقه شروع به گرم شدن با دمای ۱۰ درجه سانتیگراد در دقیقه تا حداکثر دمای ۳۲۵ درجه سانتیگراد کرد و سپس ۲۰ دقیقه بیشتر در این دما نگه داشت. دمای خط انتقال MS 280 درجه سانتیگراد، منبع MS تا ۲۳۰ درجه سانتیگراد، MS چهار تا ۱۵۰ درجه سانتیگراد بود.

مشابه نمونه های KNP، نمونه ها با استفاده از Amdis 2.71 تجزیه و تحلیل شدند. ما VOC ها را بر اساس طیف جرمی آنها با استفاده از کتابخانه طیف جرمی NIST11 شناسایی کردیم و شاخص های نگهداری منتشر شد. آلاینده های شناخته شده (به عنوان مثال سیلوکسان ها، فتالات ها) حذف شدند. ما همچنین تمام VOCهایی را که عمدتاً در نمونه‌های کنترل وجود داشتند و آنهایی که در بیش از ۹۰ درصد نمونه‌ها در کل مجموعه داده وجود داشتند حذف کردیم، با این فرض که یک VOC موجود در همه گونه‌ها احتمال بیشتری دارد که یک آلاینده باشد تا یک ترکیب واقعی. . ما بیشتر ترکیبات بسیار کمیاب را حذف کردیم: آنهایی که فقط در یک گونه و در کمتر از ۲۵ درصد نمونه‌ها وجود دارند. یا آنهایی که بیش از ۱% از کل انتشار VOC را در هر یک از گونه های مدل تشکیل نمی دهند.

تحلیل آماری

سیگنال فیلوژنتیک

از آنجایی که سه مجموعه داده با استفاده از ابزارها و روش‌های مختلف جمع‌آوری و تجزیه و تحلیل شدند، ما هر یک از آنها را به طور جداگانه تجزیه و تحلیل کردیم. در RNP و Ulm، که در آن چندین فرد در هر گونه داشتیم، ابتدا میانگین هر VOC در گونه را محاسبه کردیم. در هر سه سایت، تجزیه و تحلیل بر روی مقادیر نسبی هر VOC یا کلاس شیمیایی در یک گونه انجام شد که با تقسیم مقدار آنها بر مقدار کل VOCs موجود در گونه به دست آمد. تجزیه و تحلیل سطح ترکیبی بر روی داده های خام انجام شد که در آن هر VOC یک متغیر است. برای آنالیزهای سطح کلاس بیوشیمیایی، ما تمام VOCها را در هر سیستم به عنوان یکی از هفت کلاس شیمیایی طبقه‌بندی کردیم، بر اساس مسیر بیوشیمیایی که در آن سنتز می‌شوند [ ۳۶ ]: آلیفاتیک (مشتقات اسید چرب)، آروماتیک، ترکیبات شاخه‌ای C5، ترپنوئیدها، ترکیبات حاوی نیتروژن/گوگرد، ترکیبات حلقوی متفرقه، و ناشناخته (پرونده اضافی ۴ : جدول S2-7). ما سیگنال فیلوژنتیک را با استفاده از Kmult [ ۴۲ ]، به دنبال روشی که در Nevo و همکاران اعمال شده است، محاسبه کردیم. ۲۰۱۸ [ ۱۸ ]. این روش امکان محاسبه آماری مشابه K Blomberg [ ۴۳ ] را در یک مجموعه داده چند متغیره فراهم می کند. از آنجایی که داده‌های خام ما به شدت صفر هستند و فرض نرمال بودن روش را نقض می‌کنند، ابتدا تفاوت‌های Bray-Curtis را بین تمام نمونه‌ها در هر یک از سه مجموعه داده محاسبه کردیم. سپس یک تجزیه و تحلیل مختصات اصلی (PCoA) برای بدست آوردن متغیرهای جدید که فاصله بین همه نمونه‌ها را خلاصه می‌کند، انجام دادیم و Kmult را بر روی امتیازات همه گونه‌ها در PCoA محاسبه کردیم. به این ترتیب، این رویکرد اندازه‌گیری می‌کند که گونه‌های نزدیک به چه درجه‌ای به طور مشابه در PcoA امتیاز می‌گیرند (دین آدامز، نظر شخصی). ما از یک فیلوژنی توسط Zanne و همکاران استفاده کردیم. [ ۴۴ ]. این فیلوژنی چند پلیتومی (روابط فیلوژنتیکی حل نشده در یک جنس) دارد. با این حال، نشان داده شده است که وجود پلیتومی باعث افزایش خطای نوع I می شود، یعنی قدرت سیگنال فیلوژنتیک را بیش از حد برآورد می کند [ ۴۵ ]. از آنجایی که همه نتایج ما هیچ سیگنال فیلوژنتیکی را گزارش نمی‌کنند، این واقعیت که آنها از تجزیه و تحلیل‌هایی که اندکی مستعد مثبت کاذب هستند ظاهر می‌شوند، نتیجه‌گیری ما را تقویت می‌کند که عطر میوه رسیده سیگنال فیلوژنتیک قوی را نشان نمی‌دهد. برای تجسم نتایج (فایل اضافی ۱ : شکل S1، فایل اضافی ۲ : شکل S2، فایل اضافی ۳ : شکل S3) از همان ماتریس های عدم تشابه Bray-Curtis استفاده کردیم و یک تجزیه و تحلیل خوشه سلسله مراتبی انجام دادیم که نتایج آن با روابط فیلوژنتیکی در یک درهم‌گرام

محدودیت های رشدی

برای بررسی اینکه آیا بوی میوه رسیده توسط مشخصات VOC میوه‌های نارس محدود می‌شود، ما ضریب همبستگی گشتاور اسپیرمن را در مقدار نسبی همان کلاس‌های VOC که در بالا ذکر شد (آلیفاتیک، آروماتیک، شاخه‌های C5، ترپنوئیدها، N/S، متفرقه) محاسبه کردیم. چرخه ای). ما از یک رویکرد ناپارامتریک استفاده کردیم زیرا توزیع متغیرها نرمال نبود و بین کلاس های VOC متفاوت بود و هدف ما بدست آوردن یک رقم قابل مقایسه برای همه بود. ما اهمیت ضرایب همبستگی را با استفاده از آزمون های همبستگی آزمایش کردیم (آزمایش اینکه آیا تفاوت معنی داری با ۰ دارند یا خیر). ما ترکیبات ناشناخته را از این تجزیه و تحلیل حذف کردیم زیرا هر رابطه بین ترکیبات ناشناخته در این تجزیه و تحلیل بی معنی خواهد بود. بعید است که این استثنا بر نتایج تأثیر بگذارد زیرا ترکیبات ناشناخته ۰.۹٪ (± ۲.۱٪ SD) از مشخصات بوی میوه ها را تشکیل می دهند. ما از یک همبستگی ناپارامتریک استفاده کردیم زیرا بسیاری از توزیع‌ها دارای انحراف بودند. ما همچنین یک میانگین وزنی ضریب همبستگی اسپیرمن (متوسط ​​ضرایب همبستگی وزن شده با سهم عطر میوه رسیده) را برای تخمین شباهت کلی بین میوه های رسیده و نارس محاسبه کردیم. تمام تجزیه و تحلیل ها بر روی R 3.2.5 [ ۴۶ ] با استفاده از بسته های میمون [ ۴۷ ]، وگان [ ۴۸ ]، ژئومورف [ ۴۹ ]، فیتولز [ ۵۰ ] و dendextend [ ۵۱ ] انجام شد . کد R در https://github.com/omernevo/Constraints-in-fruit-scent-evolution موجود است.

در دسترس بودن داده ها و مواد

تمام داده های خام در فایل اضافی ۴ موجود است: جدول S1-7. کد R همه آنالیزها در https://github.com/omernevo/Constraints-in-fruit-scent-evolution موجود است.

اختصارات

VOC:

ترکیب آلی فرار

RNP:

پارک ملی رانومافانا

KNP:

پارک ملی کیبال

نه:

یونیزاسیون الکترون

NIST:

موسسه ملی علم و فناوری

TDU:

واحد دفع حرارتی

منابع

1. ^{Cipollini ML, Levey DJ. Secondary metabolites of fleshy vertebrate-dispersed fruits: adaptive hypotheses and implications for seed dispersal. Am Nat. 1997;150:346–۷۲.}

2. ^{Eriksson O, Ehrlén J. Secondary metabolites in fleshy fruits: are adaptive explanations needed? Am Nat. 1998;152:905–۷.}

3. ^{Whitehead SR, Bowers MD. Evidence for the adaptive significance of secondary compounds in vertebrate-dispersed fruits. Am Nat. 2013;182:563–۷۷.}

4. ^{Cipollini ML, Paulk E, Mink K, Vaughn K, Fischer T. Defense tradeoffs in fleshy fruits: effects of resource variation on growth, reproduction, and fruit secondary chemistry in Solanum carolinense. J Chem Ecol. 2004;30:1–۱۷.}

5. ^{Whitehead SR, Tiramani J, Bowers MD. Iridoid glycosides from fruits reduce the growth of fungi associated with fruit rot. J Plant Ecol. 2015;9:357–۶۶.}

6. ^{Nevo O, Ayasse M. Fruit scent: biochemistry, ecological function, and evolution. In: Merillon J-M, Ramawat KG, editors. Co-evolution of secondary metabolites. Cham: Springer International Publishing; 2019. p. 1–۲۳.}

7. ^{Rodríguez A, Alquézar B, Peña L. Fruit aromas in mature fleshy fruits as signals of readiness for predation and seed dispersal. New Phytol. 2013;197:36–۴۸.}

8. ^{Nevo O, Valenta K, Tevlin AG, Omeja P, Styler SA, Jackson DJ, et al. Fruit defence syndromes: the independent evolution of mechanical and chemical defences. Evol Ecol. 2017;31:913–۲۳.}

9. ^{Hodgkison R, Ayasse M, Kalko EKV, Häberlein C, Schulz S, Mustapha WAW, et al. Chemical ecology of fruit bat foraging behavior in relation to the fruit odors of two species of Paleotropical bat-dispersed figs (Ficus hispida and Ficus scortechinii). J Chem Ecol. 2007;33:2097–۱۱۰.}

10. ^{Hodgkison R, Ayasse M, Häberlein C, Schulz S, Zubaid A, Mustapha WAW, et al. Fruit bats and bat fruits: the evolution of fruit scent in relation to the foraging behaviour of bats in the new and old world tropics. Funct Ecol. 2013;27:1075–۸۴.}

11. ^{Borges RM, Bessière JM, Hossaert-McKey M. The chemical ecology of seed dispersal in monoecious and dioecious figs. Funct Ecol. 2008;22:484–۹۳.}

12. ^{Valenta K, Burke RJ, Styler SA, Jackson DA, Melin AD, Lehman SM. Colour and odour drive fruit selection and seed dispersal by mouse lemurs. Sci Rep. 2013;3:2424–۲۴۲۴.}

13. ^{Valenta K, Brown KA, Rafaliarison RR, Styler SA, Jackson D, Lehman SM, et al. Sensory integration during foraging: the importance of fruit hardness, colour, and odour to brown lemurs. Behav Ecol Sociobiol. 2015;69:1855–۶۵.}

14. ^{Valenta K, Nevo O, Martel C, Chapman CA. Plant attractants: integrating insights from pollination and seed dispersal ecology. Evol Ecol. 2017;31:249–۶۷.}

15. ^{Nevo O, Heymann EW. Led by the nose: olfaction in primate feeding ecology. Evol Anthropol. 2015;24:137–۴۸.}

16. ^{Nevo O, Garri RO, Hernandez Salazar LT, Schulz S, Heymann EW, Ayasse M, et al. Chemical recognition of fruit ripeness in spider monkeys (Ateles geoffroyi). Sci Rep. 2015;5:14895–۱۴۸۹۵.}

17. ^{Nevo O, Heymann EW, Schulz S, Ayasse M. Fruit odor as a ripeness signal for seed-dispersing primates? A case study on four neotropical plant species. J Chem Ecol. 2016;42:323–۸.}

18. ^{Nevo O, Razafimandimby D, Jeffrey JAJ, Schulz S, Ayasse M. Fruit scent as an evolved signal to primate seed dispersal. Sci Adv. 2018;4:eaat4871.}

19. ^{Nevo O, Valenta K. The ecology and evolution of fruit odor: implications for primate seed dispersal. Int J Primatol. 2018;39:338–۵۵.}

20. ^{Melin AD, Nevo O, Shirasu M, Williamson RE, Garrett EC, Endo M, et al. Fruit scent and observer colour vision shape food-selection strategies in wild capuchin monkeys. Nat Commun. 2019;10:2407.}

21. ^{Lomáscolo SB, Levey DJ, Kimball RT, Bolker BM, Alborn HT. Dispersers shape fruit diversity in Ficus (Moraceae). Proc Natl Acad Sci. 2010;107:14668–۷۲.}

22. ^{Nevo O, Razafimandimby D, Valenta K, Jeffrey JAJ, Reisdorff C, Chapman CA, et al. Signal and reward in wild fleshy fruits: does fruit scent predict nutrient content? Ecol Evol. 2019;9:10534–۴۳.}

23. ^{Nevo O, Schmitt MH, Ayasse M, Valenta K. Sweet tooth: elephants detect fruit sugar levels based on scent alone. Ecol Evol. 2020. https://doi.org/10.1002/ece3.6777.}

24. ^{Valenta K, Nevo O. The dispersal syndrome hypothesis: how animals shaped fruit traits, and how they did not. Funct Ecol. 2020. https://doi.org/10.1111/1365-2435.13564.}

25. ^{Maynard Smit J, Burian R, Kaufmann S, Alberch P, Campbell J, Goodwin B, et al. Developmental constraints and evolution. Q Rev Biol. 1985;60:265–۸۷.}

26. ^{Johnson KP, McKinney F, Sorenson MD. Phylogenetic constraint on male parental care in the dabbling ducks. Proc R Soc B Biol Sci. 1999;266:759.}

27. ^{Jordano P. Agiosperm fleshy fruits and seed dispersers: a comparative analysis of adaptation and constraints in plant–animal inetractions. Am Nat. 1995;145:163–۹۱.}

28. ^{Fischer KE, Chapman CA. Frugivores and fruit syndromes: differences in patterns at the genus and species level. Oikos. 1993;66:472–۸۲.}

29. ^{Valido A, Schaefer HM, Jordano P. Colour, design and reward: phenotypic integration of fleshy fruit displays. J Evol Biol. 2011;24:751–۶۰.}

30. ^{Valenta K, Kalbitzer U, Razafimandimby D, Omeja P, Ayasse M, Chapman CA, et al. The evolution of fruit colour: phylogeny, abiotic factors and the role of mutualists. Sci Rep. 2018;8:14302.}

31. ^{Stournaras KE, Lo E, Böhning-Gaese K, Cazetta E, Matthias Dehling D, Schleuning M, et al. How colorful are fruits? Limited color diversity in fleshy fruits on local and global scales. New Phytol. 2013. https://doi.org/10.1111/nph.12157.}

32. ^{Junker RR, Kuppler J, Amo L, Blande JD, Borges RM, van Dam NM, et al. Covariation and phenotypic integration in chemical communication displays: biosynthetic constraints and eco-evolutionary implications. New Phytol. 2017. https://doi.org/10.1111/nph.14505.}

33. ^{Kursar TA, Dexter KG, Lokvam J, Pennington RT, Richardson JE, Weber MG, et al. The evolution of antiherbivore defenses and their contribution to species coexistence in the tropical tree genus Inga. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:18073–۸.}

34. ^{Salazar D, Jaramillo MA, Marquis RJ. Chemical similarity and local community assembly in the species rich tropical genus Piper. Ecology. 2016;97:3176–۸۳.}

35. ^{Junker RR. A biosynthetically informed distance measure to compare secondary metabolite profiles. Chemoecology. 2017. https://doi.org/10.1007/s00049-017-0250-4.}

36. ^{Knudsen JT, Eriksson R, Gershenzon J, Ståhl B. Diversity and distribution of floral scent. Bot Rev. 2006;72:1–۱۲۰.}

37. ^{Gershenzon J, Dudareva N. The function of terpene natural products in the natural world. Nat Chem Biol. 2007;3:408–۱۴.}

38. ^{Rasmann S, Hiltpold I, Ali J. The role of root-produced volatile secondary metabolites in mediating soil interactions. In: Advances in selected plant physiology aspects. London: InTech; 2012.}

39. ^{Unsicker SB, Kunert G, Gershenzon J. Protective perfumes: the role of vegetative volatiles in plant defense against herbivores. Curr Opin Plant Biol. 2009;12:479–۸۵.}

40. ^{Raguso RA. Wake up and smell the roses: the ecology and evolution of floral scent. Annu Rev Ecol Evol Syst. 2008;39:549–۶۹.}

41. ^{Maynard LD, Slinn HL, Glassmire AE, Matarrita-Carranza B, Dodson CD, Nguyen TT, et al. Secondary metabolites in a neotropical shrub: spatiotemporal allocation and role in fruit defense and dispersal. Ecology. 2020;e03192. https://doi.org/10.1002/ecy.3192.}

42. ^{Adams DC. A generalized K statistic for estimating phylogenetic signal from shape and other high-dimensional multivariate data. Syst Biol. 2014;63:685–۹۷.}

43. ^{Blomberg SP, Garland T, Ives AR. Testing for phylogenetic signal in comparative data: behavioral traits are more labile. Evolution. 2003;57:717–۴۵.}

44. ^{Zanne AE, Tank DC, Cornwell WK, Eastman JM, Smith SA, FitzJohn RG, et al. Three keys to the radiation of angiosperms into freezing environments. Nature. 2014;506:89–۹۲.}

45. ^{Molina-Venegas R, Rodríguez MÁ. Revisiting phylogenetic signal; strong or negligible impacts of polytomies and branch length information? BMC Evol Biol. 2017;17:53–۵۳.}

46. ^{R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. https://www.R-project.org/. ۲۰۱۴. https://www.r-project.org/.}

47. ^{Paradis E, Claude J, Strimmer K. APE: analyses of phylogenetics and evolution in R language. Bioinformatics. 2004;20:289–۹۰.}

48. ^{Oksanen AJ, Blanchet FG, Kindt R, Legen P, Minchin PR, Hara RBO, et al. vegan: Community Ecology Package. R package version 2.4-6. 2018.}

49. ^{Adams DC, Collyer ML, Kaliontzopoulou A, Sherratt E. Geomorph: Software for geometric morphometric analyses. R package version 3.0.5. https://cran.r-project.org/package=geomorph. ۲۰۱۷.}

50. ^{Revell LJ. Phytools: An R package for phylogenetic comparative biology (and other things). Methods Ecol Evol. 2012;3:217–۲۳.}

51. ^{Galili T. dendextend: an R package for visualizing, adjusting, and comparing trees of hierarchical clustering. Bioinformatics. 2015. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btv428.}